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RT-PCR 实验原理及注意事项|同科生物
发布时间:2017-06-20        浏览次数:96        返回列表
 一、实验方法原理

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR) 的原理是:提取组织或细胞中的总 RNA,以其中的 mRNA 作为模板,采用 Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增,而获得目的基因或检测基因表达。

二、注意事项

1、在实验过程中要防止 RNA 的降解,保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中,注意避免 mRNA 的断裂;

2、为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照;

3、内参的设定:主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。

其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差;

4、PCR 不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。

故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定;

5、防止 DNA 的污染: 采用 DNA 酶处理 RNA;在可能的情况下,将 PCR 引物置于基因的不同外显子,以消除基因和 mRNA 的共线性。

同科生物简介:成立于2007年,是一家集研发、生产、销售和技术服务于一体专注于生命医学和生物技术领域的高科技企业。主营业务有科研产品、诊断试剂、分子诊断和技术服务等,主要服务于科研机构、大专院校、医院和工业等客户。

生产科研:同科生物www.toneker.com搭建多个研发与合作技术平台(博士后实践基地、院士工作站、同济大学人才培养与产学研合作基地及生物研究中心等),为技术创新提供了坚实的基础保障。拥有三类体外试剂生产中心、仪器生产中心、研发质检实验室等、厂房和实验面积达8000多平米,仪器设备设施先进齐全(包括定量PCR仪、生物安全柜、核酸蛋白测定仪、高压细胞破碎仪、FPLC等系列高端精密仪器设备)。